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洛伐他汀分解酶调转基因lovE和mkH的仿造及其序列综合比拟

中国佳诚论文网www.thesislib.com编者。

                          笔者：黄欣 朱碧云 吕带弟 陈伟立 黄晓琳 李浩明 

【撮要】   手段 仿造红曲霉和土曲霉洛伐他汀分解酶调转基因lovE和mkH，并停止序列综合和同源性比拟。办法 依据GeneBank土曲霉和红曲霉洛伐他汀分解酶基因序列设想引物，以土曲霉和红曲霉基因组DNA为沙盘PCR扩增lovE和mkH基因并仿造到pMD19T simple载体。应用DNAMAN等硬件以及互联网络资源对于lovE和mkH测序后果与其补码的胆固醇酸序列停止综合比对于。后果 辨别扩增失去1 512 bp和1 464 bp的手段片段lovE和mkH。论断 lovE和mkH同源性很高，并与GeneBank中有关已知序列根本相反，是洛伐他汀生物分解酶调转基因，且其抒发产物为GAL4类转录因数。

【要害词】   土曲霉 红曲霉 洛伐他汀 转录因数 调转基因

洛伐他汀是氨基生物分解中的要害酶HMGCoA复原酶的合作性抑止剂，是眼前 医治 高血脂症最无效的药品之一［1-3］，它可下调炎症有关转录因数的抒发，减缓动脉粥样软化［4,5］，并可推进恶性甲状腺细胞凋亡［6,7］，存正在抑止乳腺癌细胞增殖的性能［8］。
      　　
　　土曲霉洛伐他汀分解酶基因簇囊括lovAlovG以及lovI和lvrA等基因［9-11］。红曲霉洛伐他汀分解酶基因簇囊括mkAmkI等9个基因。内中lovE和mkH辨别是土曲霉和红曲霉洛伐他汀生物分解的调转基因，补码GAL4类转录因数，其胆固醇酸序列中半胱氨酸富集的DNA联合海域标明含有Zn2Cys6型锌指构造域［12-14］。为深化钻研洛伐他汀生物分解调转基因的生物学性能并应用这类转录因数来调转洛伐他汀分解新陈代谢，本钻研初次从国际罕用 轻工业 原始起程菌株土曲霉CCTCC AF93208和红曲霉CICC5031基因组中PCR扩增仿造洛伐他汀分解酶调转基因，并对于该基因和其补码的卵白产物停止序列综合比照。      

　　1    试验资料

　　1.1    菌株和造就基
      　　
　　土曲霉（Aspergillus terrus）CCTCC AF93208： 中国 垂范造就物保藏核心;红曲霉（Monascus anka）CICC 5031：中国轻工业微生物菌苗保藏核心;大肠杆菌DH5α为本试验室保藏;大肠杆菌LB造就基和LB/Amp造就基均按试验室罕用造就基的配置办法配置。
      　　
　　垂直面造就基［15］（g/L）：察氏造就基（蔗糖 30 g，NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.  5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 15 g，污浊水 1 000 mL）。
      　　
　　菌丝成长造就基［15］（g/L）：野葡萄糖 50 g，酵母菌膏 10 g，西红柿酱 20 g，CaCO3 1 g，pH 7.2～7.5。

　　1.2    试药
      　　
　　PCR引物由?
?
应战生物技能无限公司分解。Taq酶采纳fermentas的Taq recombinant。OMEGA的胶回收试药盒D250101。Takara公司的pMD19T simple仿造载体。Takara公司的DNA Marker DL2000和100 bp ladder。其余通例化学试药均为外来综合纯。

　　2    试验办法

　　2.1    造就办法
      　　
　　用2 mL无菌水显影孢子，接入液体垂直面造就。液体垂直面造就7 d后，以5 mL拆洗下，浓缩至深浅为107个/mL，取2 mL退出100 mL菌丝成长造就基，转速150 r/min，28℃造就4 d。

　　2.2    基因组DNA提取
      　　
　　过滤取菌丝球（过分吸干），称重并转入-20℃预冷的研钵。每克菌丝球退出3 g石英砂，0.4 mL提取液［100 mmol/L TrisHCl(pH8.0),20 mmol/L Na2EDTA,0.5 mol/L NaCl,1% SDS］，0.5 mL无机液（酚/氯仿/异戊醇 （容积比）25∶24∶1）。将上述混合物于预冷研钵中猛烈研磨1 min直到成黏稠状细粉。每克菌丝球再退出4 mL提取液，2 mL无机液，充足混匀。用已剪枪头吸转至1.5 mL EP管，室温16 000 g离心5 min。吸转水相到新管，加0.6倍容积异甲醇，室温静置10 min，4 ℃16 000 g离心15 min，弃废液。95%酒精润洗积淀，稍和风干。加340 μL重滤液1［10 mmol/L TrisHCl(pH8.0),1 mmol/L Na2EDTA,20 μg/mL RNaseA］，37℃水浴30 min。按前对比无机液再抽提一次，300 μL水相转新管。退出0.5倍容积7.5 mol/L醋酸铵滤液和2.  5倍容积95%酒精匀称混合，-20℃静置30 min，4℃16 000 g离心15 min，弃废液。95%酒精润洗积淀，风干。每管退出100 μL重滤液2［10 mmol/L TrisHCl(pH8.0),1 mmol/L Na2EDTA］，-20 ℃销毁［16］。

　　2.3    PCR引物设想
      　　
　　依据GeneBank上宣布的土曲霉和红曲霉洛伐他汀生物分解基因簇（登录号为AF141925和DQ176595）中lovE和mkH基因设想如次引物扩该基因。lovEF: ATGGCTGCAGATCAAGGTATAT；lovER: TCATGGAGGAATATTGTTGAGG；预期lovE产物大小为1 512 bp。mkHF: TTAGGAGGCCAGGTTGTGTTGG；mkHR: ATGGCCCTATCGCCAGTCCAGG；预期mkH产物大小为1 464 bp。

　　2.4    PCR反响
      　　
　　反响系统：10×buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 1.  2 μL,10 μmol/L dNTPs 0.4 μL,20 μmol/L 引物组各0.4 μL，ddH2O 14.5 μL，DNA 1 μL，Taq酶 0.1 μL。总系统20 μL。
      　　
　　热重复环境：94 ℃预变性5 min后，以94 ℃30 s，50 ℃20 s，72 ℃1 min 40 s顺序重复40次，蔓延72 ℃20 min。

　　2.5    手段片段的仿造与测序
      　　
　　1%的琼脂糖凝胶电泳结合PCR产物，再按胶回收试药盒操作回收纯化PCR产物。按pMD19T simple载体1 μL，回收DNA4 μL，solutionⅠ（含T4联接酶和联接酶缓冲液）5 μL的对比微微打匀于16 ℃水浴联接2 d。大肠杆菌DH5α感想态制备及转化均按成员仿造指北方法操作。仿造片段交由?
?
应战生物技能无限公司双脱脂法双向内定并拼接。

　　2.6    转化子考证
      　　
　　蓝黑斑挑选挑取黑斑单仿造菌核PCR考证。
      　　
　　反响系统：10×buffer 1 μL，25 mmol/L MgCl2 1.  2 μL,10 μmol/L dNTPs 0.2 μL,20 μmol/L 引物组各0.2 μL，ddH2O 7.15 μL，DNA 无菌枪头蘸取，Taq酶 0.1 μL。总系统10 μL。
      　　
　　热重复环境：94℃预变性5 min后，以94 ℃30 s，50 ℃20 s，72 ℃1 min40 s顺序重复30次，蔓延72 ℃ 5 min。

　　2.7    序列综合比对于
      　　
　　采纳DNAMAN硬件将测序后果与GeneBank已知序列停止比对于，并经过NCBI等 网络 资源综合基因序列及其对于应卵白的生化本质、初级构造和性能。

　　3    后果与综合

　　3.1    PCR扩增后果
       
　　见图1，标明对于lovE和mkH扩增失去与预期大小分歧的产物，约为1 500 bp。

　　M为DNA Marker DL2000（从上至下辨别是2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；0为阳性比照即没加模

　　图1    PCR扩增后果（A为lovE，B为mkH）（略）

　　Figure 1    Electrophoresis of PCR products on 1% agarose gel（A for lovE and B for mkH）

　　3.2    菌核PCR考证后果
     
　　见图2，对于lovE和mkH扩增失去了与预期大小分歧的产物，约为1 500 bp。

　　A图中M为DNA marker 100 bp ladder（从上至下辨别是1 500 bp，1 000 bp，900 bp，800 bp，700 bp，600 bp，500 bp，400 bp，300 bp，200 bp，100 bp）；B图中M为DNA Marker DL2000（从上至下辨别是2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；0为阳性比照即没加沙盘DNA；A图中1-9是lovE的菌核PCR扩增后果；B图中1-6是mkH的菌核PCR扩增后果

　　图2    菌核PCR后果（A为lovE，B为mkH）（略）

　　Figure 2    Electrophoresis of colony PCR products on 1% agarose gel（A for lovE and B for mkH）

　　3.3    扩增片段测序后果及综合

　　3.3.1    核苷酸及胆固醇酸综合    将重组菌苗交?
?
应战生物技能无限公司测序，lovE的3次测序后果与GeneBank中lovE经过DNAMAN比对于仅正在第614位碱基处由C置换了T，补码的胆固醇酸也仅正在第205位胆固醇酸处由Ala置换了Val；而mkH的3次测序后果与GeneBank中mkH彻底分歧。由此可见两者之间的差别能够是集体多态性，也证实了洛伐他汀分解酶调转基因种间传统水平极高。

　　将测序后果提交到GeneBank中停止blastn（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）比对于，lovE和mkH辨别与GeneBank中登录号为AF141925.1和DQ176595.1(辨别补码Aspergillus terrus调转卵白和Monascus pilosus转录因数)的类似性到达99.  9%和100%，标明仿造片段应为洛伐他汀分解酶调转基因。且lovE基因长1 512 bp，补码503个胆固醇酸，没有含内含子构造；而mkH基因长1 464 bp，补码455个胆固醇酸，且含有一长为96 bp的内含子。中国佳诚论文网www.thesislib.com编者。
      　　
　　将两基因的测序后果递交DNAMAN硬件停止同源性综合比对于，两基因类似性较高（核酸序列分歧性identity到达67.92%），而将其对于应补码的胆固醇酸序列比对于，胆固醇酸序列分歧性identity到达60.  59%，注明了洛伐他汀分解酶调转基因正在属间也存正在较高的同源性和传统水平。BLASTn比对于中得悉具有高低类似性（identities辨别为67%和74%）。
      　　
　　测序后果的胆固醇酸序列提交到SWISSPROT数据库经过适用ProtParam顺序（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）输入lovE卵白状况如次：胆固醇酸数503；成员量55427.3 Da；成员式C2394H3799N709O757S25；原子团总和7 684；实践等电点6.08；脂膏族指数75.31；总均匀疏医道-0.397。而mkH卵白状况如次：胆固醇酸数455；成员量49305.6 Da；成员式C2139H3394N618O673S24；原子团总和6 848；实践等电点5.86；脂膏族指数78.29；总均匀疏医道-0.296。

　　3.3.2    亚细胞定位综合    亚细胞定位钻研（http://psort.nibb.ac.jp & http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）标明lovE和mkH卵白未显现垂范的N端信号肽海域，SubLoc辨别以84%，94%的准确度和RI=3，5的牢靠性指数展望两卵白正在核内。SignalP综合（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）展望后果显现两卵白均非分泌卵白，且具有信号肽的能够性辨别为10.4%和0。

　　3.3.3    疏医道综合    疏水和亲水是胆固醇酸固部分特点，蛋白胨构造的特色是疏水和亲水间的失调，其构造的稳固正在很大水平上有赖于成员内的疏水作用。疏医道展望和综合关于蛋白胨次级构造的展望及性能综合都有较为主要的 参考 意思。将测序后果递交到效劳器http://www.expasy.org/cgibin/protscale.pl采纳kyte和Doolittle的办法得出两卵白大全体胆固醇酸是亲水的，因而归于亲水卵白。这也和signalP以及亚细胞定位综合展望后果分歧为核内的非分泌卵白，卵白经过核孔化合体进入核内需求亲水基团的参加。

　　3.3.4    卵白初级构造及性能综合    蛋白胨一般含有一些构造域和特别的传统位点，而那样的构造触及那种退化来源或者许担任特别的性能。将测序后果递交到主动比拟同源卵白建模效劳器SWISS (http://swissmodel.expasy.org/SWISSMODEL.html)及PredictProtEin(http://www.predictprotEIn.org/)对于lovE和mkH补码胆固醇酸序列停止初级构造综合。再经过VAST Search Structure（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vastsearch.html）综合上述失掉的pdb资料，其后果用Cn3D硬件如图3所示：
 
　　图3    卵白初级构造综合（A为lovE卵白，B为mkH卵白）（略）

　　Figure 3    Advanced structure analysis（A for lovE protein and B for mkH protein）       

　　图3中两卵白均存正在Zn2Cys6双核簇合物的锌指构造DNA联合构造域，该传统构造域发觉于如GAL4型的转录因数，曾正在酿酒酵母菌中证明GAL4为半乳糖诱导的基因抒发正调转子。此构造域由2个α电钻萦绕成富集半胱氨酸的锌指基序（参加Zn依托性的DNA联合）并由无规定卷曲并联兴起。此类构造域还触及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸盐、饴糖和半乳糖的新陈代谢，以及酰胺和α胆固醇丁酸的降解与亮氨酸的生物分解等。

　　4    议论
      　　
　　洛伐他汀是眼前 医治 高血脂症的罕用药品之一。国际 轻工业 化消费洛伐他汀的频率并没有现实，致使钻研者们纷繁以减产洛伐他汀为指标展开多范围的钻研。眼前从基因工事范围动手好转其产量变化热点。白文仿造的lovE和mkH基因补码产物是一度洛伐他汀生物分解的调转卵白或者转录因数，对于其深化钻研将无助于于了解和掌握洛伐他汀生物分解。
      　　
　　Kennedy、Park等将lovE基因渐变失活招致检测没有就任何洛伐他汀两头产物，同声将一度额定正片的lovE转化土曲霉，洛伐他汀产量增多5～7倍［10,16］。从上述数据能够看出对于lovE和mkH基因以及其补码卵白的构造性能的进一步钻研将为深化了解洛伐他汀生物分解及其遗传调转范围需要参考，且为进一步抒发基因、纯化有关卵白、制备多仿造抗原、钻研基因省外转录、转录因数与DNA的省外模仿联合以深化理解此类转录因数生物学性能和作用机理奠定了试验根底。
      　　
　　本钻研应用国内互联网络生物消息学资源，经过 打算 综合两卵白情理化学特点，得悉此两核卵白和一些转录因数以及调转序列补码产物有单独的GAL4类锌指构造传统序列区。类似性搜寻比对于得悉lovE和mkH没有管基因还是补码产物序列都存正在高低类似性，具有单独的DNA联合传统序列。

【参考 教案 】
  　　［1］ AUER J, EBER B. A clinical focus on statins［J］. Curr Opin Investig Drugs, 2001, 2(3):382-388.

　　［2］ YOON N Y, KIM H R, CHUNG H Y, et al. Antihyperlipidemic effect of an edible brown algae, Ecklonia stolonifera, and its constituents on poloxamer 407induced hyperlipidemic and cholesterolfed rats［J］. Arch Pharm Res, 2008, 31(12):1564-1571.

　　［3］ SANDHYA V G, RAJAMOHAN T. Comparative evaluation of the hypolipidemic effects of coconut water and lovastatin in rats fed fatcholesterol enriched diet［J］. Food Chem Toxicol, 2008, 46(12):3586-3592.

　　［4］ DICHTL W, DULAK J, FRICK M, et al. HMGCoA reductase inhibitors regulate inflammatory transcription factors in human endothelial and vascular smooth muscle cells［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003, 23(1): 58-63.

　　［5］ MUSUNURU K, BLUMENTHAL R S. The implications of the ezetimibe and simvastatin in hypercholesterolemia enhances atherosclerosis regression trial: a return to first principles［J］. Clin Cardiol, 2008, 31(6):288-290.

　　［6］ ZHONG W B, WANG C Y, CHANG T C, et al. Lovastatin induces apoptosis of anaplastic thyroid cancer cells via inhibition of protein geranylgeranylation and de novo protein synthesis［J］. Endocrinology, 2003, 144(9): 3852-3859.

　　［7］ LAEZZA C, FIORENTINO
      　　
　　将测序后果提交到GeneBank中停止blastn（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）比对于，lovE和mkH辨别与GeneBank中登录号为AF141925.1和DQ176595.1(辨别补码Aspergillus terrus调转卵白和Monascus pilosus转录因数)的类似性到达99.  9%和100%，标明仿造片段应为洛伐他汀分解酶调转基因。且lovE基因长1 512 bp，补码503个胆固醇酸，没有含内含子构造；而mkH基因长1 464 bp，补码455个胆固醇酸，且含有一长为96 bp的内含子。
      　　
　　将两基因的测序后果递交DNAMAN硬件停止同源性综合比对于，两基因类似性较高（核酸序列分歧性identity到达67.92%），而将其对于应补码的胆固醇酸序列比对于，胆固醇酸序列分歧性identity到达60.  59%，注明了洛伐他汀分解酶调转基因正在属间也存正在较高的同源性和传统水平。BLASTn比对于中得悉具有高低类似性（identities辨别为67%和74%）。
      　　
　　测序后果的胆固醇酸序列提交到SWISSPROT数据库经过适用ProtParam顺序（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）输入lovE卵白状况如次：胆固醇酸数503；成员量55427.3 Da；成员式C2394H3799N709O757S25；原子团总和7 684；实践等电点6.08；脂膏族指数75.31；总均匀疏医道-0.397。而mkH卵白状况如次：胆固醇酸数455；成员量49305.6 Da；成员式C2139H3394N618O673S24；原子团总和6 848；实践等电点5.86；脂膏族指数78.29；总均匀疏医道-0.296。

　　3.3.2    亚细胞定位综合    亚细胞定位钻研（http://psort.nibb.ac.jp & http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/）标明lovE和mkH卵白未显现垂范的N端信号肽海域，SubLoc辨别以84%，94%的准确度和RI=3，5的牢靠性指数展望两卵白正在核内。SignalP综合（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）展望后果显现两卵白均非分泌卵白，且具有信号肽的能够性辨别为10.4%和0。

　　3.3.3    疏医道综合    疏水和亲水是胆固醇酸固部分特点，蛋白胨构造的特色是疏水和亲水间的失调，其构造的稳固正在很大水平上有赖于成员内的疏水作用。疏医道展望和综合关于蛋白胨次级构造的展望及性能综合都有较为主要的参考意思。将测序后果递交到效劳器http://www.expasy.org/cgibin/protscale.pl采纳kyte和Doolittle的办法得出两卵白大全体胆固醇酸是亲水的，因而归于亲水卵白。这也和signalP以及亚细胞定位综合展望后果分歧为核内的非分泌卵白，卵白经过核孔化合体进入核内需求亲水基团的参加。

　　3.3.4    卵白初级构造及性能综合    蛋白胨一般含有一些构造域和特别的传统位点，而那样的构造触及那种退化来源或者许担任特别的性能。将测序后果递交到主动比拟同源卵白建模效劳器SWISS (http://swissmodel.expasy.org/SWISSMODEL.html)及PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)对于lovE和mkH补码胆固醇酸序列停止初级构造综合。再经过VAST Search Structure（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vastsearch.html）综合上述失掉的pdb资料，其后果用Cn3D硬件如图3所示：
 
　　图3    卵白初级构造综合（A为lovE卵白，B为mkH卵白）（略）

　　Figure 3    Advanced structure analysis（A for lovE protein and B for mkH protein）       

　　图3中两卵白均存正在Zn2Cys6双核簇合物的锌指构造DNA联合构造域，该传统构造域发觉于如GAL4型的转录因数，曾正在酿酒酵母菌中证明GAL4为半乳糖诱导的基因抒发正调转子。此构造域由2个α电钻萦绕成富集半胱氨酸的锌指基序（参加Zn依托性的DNA联合）并由无规定卷曲并联兴起。此类构造域还触及精氨酸、脯氨酸、嘧啶、奎尼酸盐、饴糖和半乳糖的新陈代谢，以及酰胺和α胆固醇丁酸的降解与亮氨酸的生物分解等。

　　4    议论
      　　
　　洛伐他汀是眼前医治高血脂症的罕用药品之一。国际轻工业化消费洛伐他汀的频率并没有现实，致使钻研者们纷繁以减产洛伐他汀为指标展开多范围的钻研。眼前从基因工事范围动手好转其产量变化热点。白文仿造的lovE和mkH基因补码产物是一度洛伐他汀生物分解的调转卵白或者转录因数，对于其深化钻研将无助于于了解和掌握洛伐他汀生物分解。
      　　
　　Kennedy、Park等将lovE基因渐变失活招致检测没有就任何洛伐他汀两头产物，同声将一度额定正片的lovE转化土曲霉，洛伐他汀产量增多5～7倍［10,16］。从上述数据能够看出对于lovE和mkH基因以及其补码卵白的构造性能的进一步钻研将为深化了解洛伐他汀生物分解及其遗传调转范围需要参考，且为进一步抒发基因、纯化有关卵白、制备多仿造抗原、钻研基因省外转录、转录因数与DNA的省外模仿联合以深化理解此类转录因数生物学性能和作用机理奠定了试验根底。
      　　
　　本钻研应用国内互联网络生物消息学资源，经过打算综合两卵白情理化学特点，得悉此两核卵白和一些转录因数以及调转序列补码产物有单独的GAL4类锌指构造传统序列区。类似性搜寻比对于得悉lovE和mkH没有管基因还是补码产物序列都存正在高低类似性，具有单独的DNA联合传统序列。

【参考教案】
  　　［1］ AUER J, EBER B. A clinical focus on statins［J］. Curr Opin Investig Drugs, 2001, 2(3):382-388.

　　［2］ YOON N Y, KIM H R, CHUNG H Y, et al. Antihyperlipidemic effect of an edible brown algae, Ecklonia stolonifera, and its constituents on poloxamer 407induced hyperlipidemic and cholesterolfed rats［J］. Arch Pharm Res, 2008, 31(12):1564-1571.

　　［3］ SANDHYA V G, RAJAMOHAN T. Comparative evaluation of the hypolipidemic effects of coconut water and lovastatin in rats fed fatcholesterol enriched diet［J］. Food Chem Toxicol, 2008, 46(12):3586-3592.

　　［4］ DICHTL W, DULAK J, FRICK M, et al. HMGCoA reductase inhibitors regulate inflammatory transcription factors in human endothelial and vascular smooth muscle cells［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2003, 23(1): 58-63.

　　［5］ MUSUNURU K, BLUMENTHAL R S. The implications of the ezetimibe and simvastatin in hypercholesterolemia enhances atherosclerosis regression trial: a return to first principles［J］. Clin Cardiol, 2008, 31(6):288-290.

　　［6］ ZHONG W B, WANG C Y, CHANG T C, et al. Lovastatin induces apoptosis of anaplastic thyroid cancer cells via inhibition of protein geranylgeranylation and de novo protein synthesis［J］. Endocrinology, 2003, 144(9): 3852-3859.

　　［7］ LAEZZA C, FIORENTINO L, PISANTI S, et al. Lovastatin induces apoptosis of krastransformed thyroid cells via inhibition of ras farnesylation and by modulating redox state［J］. J Mol Med, 2008, 86(12):1341-1351.

　　［8］ YU X, LUO Y, ZHOU Y, et al. BRCA1 overexpression sensitizes cancer cells to lovastatin via regulation of cyclin D1CDK4p21WAF1/CIP1 pathway: analyses using a breast cancer cell line and tumoral xenograft model［J］. Int J Oncol, 2008, 33(3):555-563.

　　［9］ HENDRISKSON L, DAVIS C R, ROACH C, et al. Lovastatin biosynthesis in Aspergillus terrus: characterization of blocked mutants, enzyme activities and a mulifunctional polyketide synthase gene［J］. Chem Biol, 1999, 6(7): 429439.

　　［10］ KENNEDY J, AUCLAIR K, KENDREW S G, et al. Modulation of polyketides synthase activity by accessory proteins during lovastatin biosynthesis［J］. Science,1999, 284(5418): 1368-1372.

　　［11］ SUTHERLAND A, AUCLAIR K, VEDERAS J C. Recent advances in the biosynthetic studies of lovastatin ［R］. Curr Opin Drug Discov Devel, 2001, 4(2): 229-236.

　　［12］ TODD R B, ANDRIANOPOULOS A. Evolution of a fungal regulatory gene family: The Zn(II)2Cys6 binuclear cluster DNA binding motif［J］. Fungal Genet Biol, 1997, 21(3): 388-405.

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